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基于外显子捕获测序的急性髓系白血病微小残留病监测平台
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挂牌 挂牌开始时间: 2020-11-30 剩余时间:16月
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徐州医科大学
电话 138xxxx6778
目标一:通过外显子捕获技术和二代测序技术检测AML病人中突变的基因以及突变率:
与现有的临床诊断指标相结合,优化出一套AML MRD监测的标准化方案;结合AML的临床治疗相关方案,提炼出AML MRD监测的新方案和相对应的临床治疗策略,为评估疾病状态、判断疗效、预测复发、指导治疗等提供科学的依据。这种灵敏度高、特异性强及稳定可靠的MRD检测平台的建立有助于评估疾病状态、判断疗效、预测复发并有效的提高临床移植患者的生存率和生活质量。
目标二:确立标准化的和高度个体化的MRD监测的方案并用于临床
本研究将外显子捕获和二代测序技术用于MRD的标准化监测方案的平台建立,并将获得的可以作为MRD检测的靶标组合其与白血病的复发相联系,尽量优化个人MRD监测方案提高患者的生存率。鉴于AML的异质性,其MRD检测的规范化和科学化亟待进一步完善,我们拟在前期基础与临床研究的基础上,进一步利用外显子捕获测序检测AML的个体化靶标,建立一套规范和通用的AML MRD临床监测路径为临床AML的规范化诊疗提供新策略。

1、具体研究开发内容和要重点解决的关键技术问题;

研究内容包括两部分:

第一部分:MRD预测指标的建立

本部分拟利用外显子捕获技术和二代测序的方法监测AML病人样本中的突变基因和相关基因的突变率。然后利用RT-PCRWestern blot的方法检测病人样本中以上突变基因的mRNA和蛋白质的表达水平,并通过结构模拟的方法分析点突变对蛋白质结构的影响以及对预后可能产生的影响,最后通过统计学分析上述指标与白血病复发的概率及复发的相关性和聚类分析,筛选出有统计学意义的指标作为MRD的监测指标。完成后,将确定后的指标用于临床研究。

第二部分:AML复发的预防和治疗

临床研究中,将患者治疗前、治疗中、缓解后和移植后的标本,进行上述突变基因的动态监测,制定出符合临床应用的MRD监测的个体化方案。用于指导临床患者复发的预防和治疗。将患者MRD监测的相关分子和患者的预后相结合,利用统计学的方法检测这些指标与患者预后的相关性。根据确定的MRD监测结果进行AML复发的预防和治疗策略制订。如果MRD监测提示AML复发的可能性大,则应该提前做好不同的预防策略进行其复发的预防。

关键技术问题:

本研究的关键在于通过外显子捕获技术和二代测序技术检测AML病人中突变的基因以及突变率并建立标准化的AML MRD监测方案,结合病人缓解后的随访并利用不同的技术检测基因在mRNA和蛋白水平的表达情况,进而依据筛选得到的MRD监测结果提前进行AML复发的预防和治疗。本研究通过测序检测到的突变基因的突变的突变率、表达及其与白血病复发之间的关系,统计两者之间的关系确立标准化的和高度个体化的MRD监测的方案并用于临床是本研究的关键问题。

2. 具体实施方案

2.1 患者入组条件和常规MRD检测处理

2.1.1 患者入组条件

  选取徐州医学院附属医院血液科和三家合作医院的住院患者,视下列情况入组:

 1 AML初治患者

 2] 无心、肝、肾等重要器官功能不全或衰竭

 3] 患者精神正常,无精神病病史

 4] 患者本人对研究知情且签署书面知情同意书

2.1.2 入组患者的治疗和常规MRD检测

  入组患者行常规的骨髓细胞学、免疫分型、染色体、融合基因筛查、FLT3-c-Kit-NPM1突变检测和FISH检测,完善MICM分型后接受去甲氧柔红霉素+阿糖胞苷方案化疗。化疗缓解后标危患者接受大剂量阿糖胞苷巩固,非老年高危患者若有适宜供者采用异基因造血干细胞移植。

  每位入组患者均视MICM分型情况判断有无常规检测靶点,如有靶点每月行常规MRD监测。

 

2.2  外显子捕获和新一代测序筛查个体化的MRD监测靶点

2.2.1 AML外显子组的捕获和建库

  选取初治AML患者,在经医院伦理委员会批准和患者本人知情后取患者骨髓液3-5ml,淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞,置于-80℃备用。同时行活检取患者约50-100mg皮肤组织,置于-80℃备用。

  分别使用Promega公司的Wizard SV Genomic DNA Purification试剂盒提取患者骨髓单个核细胞和皮肤组织的基因组DNA,提取过程按照试剂盒说明书进行。将患者骨髓单个核细胞基因组DNA(代表白血病细胞)和皮肤基因组DNA(代表体细胞)保存于-20℃备用。

  利用超声将纯化的基因组DNA剪切成约300-400bp的片段,电泳切胶回收适宜大小(300-400bp)的DNA片段,用Illumia公司的TruSeq Exome Enrichment Kit进行外显子区富集。取1μg富集后的外显子组DNA,利用Illumina公司的TruSeq DNA Sample Prep Kit进行建库。外显子组富集和建库操作均遵照Illumia的技术规范进行。

2.2.2 外显子组的测序、数据分析

  使用MiSeq测序仪以2*250bp的测序模式和15倍的覆盖率对构建的外显子组文库进行深度测序。测序Reads数控制在每个样本约3M

  使用DNAStar软件分析测序后的数据,分别将同一患者白血病细胞的外显子组序列和体细胞的外显子序列与人类外显子参考序列进行比对,筛选出白血病细胞中存在突变的外显子并定位突变基因。筛选的标准为白血病细胞的外显子存在突变而体细胞外显子序列不存在该突变点;如体细胞也存在该突变点则判断为单核苷酸多态性变异。

2.2.3 测序结果的后续验证

  根据突变的基因定位,设计特异引物使用NEB公司的Q5超保真DNA聚合酶扩增突变基因,经传统的毛细管测序验证突变的存在。

 

2.3  测序中发现的MRD新靶标与白血病生物学行为的相关性研究

2.3.1 计算机辅助分析突变基因对编码蛋白蛋白结构的影响

  根据患者外显子捕获测序所获得的信息,在每个患者的测序结果中选取与细胞增殖分化、能量代谢调控和凋亡调控有关的基因,分析突变引起的蛋白氨基酸序列改变。突变存在以下3种可能:

 1] 引起对应蛋白氨基酸序列改变

 2] 中性突变

 3] 造成编码蛋白发生移码或提前终止

  如突变基因编码蛋白存在氨基酸序列改变或提前终止,利用Swiss-Model软件对突变蛋白进行同源建模,模拟相应氨基酸序列改变对蛋白质空间结构结构的影响。如分析结果为中性突变,则在后续分析忽略该位点。

2.3.2 聚类分析筛选AML中高频受累的基因群

  分析300AML患者外显子捕获测序结果,统计出高频受累的基因。使用DAVID软件分析受累基因在不同通路上的富集。根据通路受累的结果再次对突变基因进行聚类分析,筛选出AML中常受累的基因簇。

2.3.3 新基因突变对AML生物学行为的影响

  2.3.12.3.2部分中筛选到的靶标中依照在AML中的重现频率和对下游信号通络影响的显著性选取15-20个备选基因。

  如果同源建模分析结果提示蛋白功能增强或稳定性增强(如泛素化位点消失等),则克隆该突变基因或通过定点突变技术形成获取突变基因,并连接入pCDNA3.1真核表达载体。电穿孔转染AML细胞株如KG-1U937HL-60THPG418筛选稳定转染细胞株。

  如分析结果提示蛋白功能受损,则设计3对对应的shRNA干扰序列并连接入pSliencer3.1载体。电穿孔转染AML细胞株如KG-1U937HL-60THPG418筛选稳定转染细胞株。如分析结果提示蛋白表达障碍,则先经Western Blot在原代细胞上确认后再在AML细胞株上行基因沉默操作。

观察指标:

 1 CCK-8法测定细胞增殖率

 2] 流式细胞术测定CD34+CD38-CD123+CD11b阳性率和强度

 3] 对柔红霉素和阿糖胞苷的敏感性

 4] 羧甲基纤维素半固体培养基集落形成能力

 通过以上指标,评价我们新鉴定的AML相关基因突变对白血病细胞生物学行为的影响。

 

2.4  MRD检测组合靶标的筛选和优化

2.4.1 MRD个体化监测靶点的确立

  根据每位患者白血病细胞外显子捕获测序的分析结果,选取5-10个引起编码蛋白改变且与AML发生有关的靶点。

2.4.2 MRD监测组合靶标的确立

  分析200AML患者外显子捕获测序结果,并结合2.3部分研究结果,根据测序结果显示的AML相关突变依照出现频率和与AML发病的相关性视情况选取一组候选基因。要求在该组候选基因中,至少95%的患者存在三个以上的突变点且体细胞中不得存在该突变。力争将MRD监测组合的靶点控制在48个以内。

 

2.5 通用化AML MRD检测流程的建立和优化

2.5.1 个体化AML MRD检测流程的建立

  按每位患者外显子捕获测序结果定制的MRD监测靶标设计引物,通过荧光定量PCR检测骨髓单个核细胞基因组中突变基因的拷贝数变化。患者缓解后每月测定一次。

2.5.2 通用性AML MRD检测流程的建立

  根据2.5.2部分研究选定的靶点设计引物,通过荧光定量PCR检测患者骨髓单个核细胞基因组中突变型靶基因的拷贝数变化。患者缓解后每月测定一次。

2.5.3 基于外显子捕获测序筛选靶点的MRD检测策略的非劣效性分析与MRD阈值的标准化

  分析基于外显子捕获测序筛选靶点监测的MRD值和白血病复发风险的关系,寻找白血病复发率明显增高的拐点,确定MRD的阈值。

  分析入组的300例患者中具有常规MRD检测靶点的比例,分析基于外显子捕获测序的方法是否具有更好的通用性。

  分析用常规MRD监测方法检测的MRD值与基于外显子捕获测序筛选靶点监测的MRD值的一致性,并结合患者的预后及复发率分析基于外显子捕获测序筛选靶点监测的MRD值是否能够有效指导临床治疗策略,以及在指导治疗和预测复发方面是否优于传统的MRD监测方法。

  进一步分析通用性AML MRD检测方案与按每位患者外显子捕获测序结果定制的MRD监测方案是否在指导临床治疗和预测复发上具有一致性。

2.5.4 视情况对MRD监测流程进行进一步优化。


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